2025 年 2 月 6 日 15:30，大橡科技市场部于北京发布消息，近年来，类器官研究在生物医学领域迅猛发展，其中血管类器官（VOs）凭借能精准模拟人体血管结构与功能的特性，成为血管生成研究的关键工具。血管生成在组织修复、胚胎发育等正常生理过程中发挥着不可或缺的作用，然而，一旦其失控，便会引发糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、癌症等多种疾病。特别是在肿瘤生长时，异常的血管生成会为癌细胞提供充足营养，助力其扩散。目前，针对血管内皮生长因子（VEGF）的抗血管生成药物虽应用广泛，但副作用和耐药性问题限制了其治疗效果。传统高通量药物筛选技术难以完整模拟复杂的三维血管结构，且操作繁杂。
近日，北京大学基础医学院血管稳态与重构全国重点实验室的王凯团队在《Angiogenesis》期刊（影响因子 9.2）发表研究成果。该团队借助人类多能干细胞构建血管类器官，成功重现了体内血管生成的动态过程，这不仅增强了实验与人体生理的相关性，还简化了操作流程，大幅提升了高通量筛选的效率与准确性。
研究亮点
构建创新双报告基因细胞系
ChinaBio生物医药投融资大会了解到，研究团队运用 CRISPR/Cas9 技术，在内源性的 PECAM1 和 ACTA2 基因位点引入荧光标记，成功构建了 PECAM1-mRuby3-secNluc; ACTA2-EGFP 双报告系统。该细胞系能够同时对内皮细胞（ECs）和平滑肌细胞（SMCs）进行标记，实现对血管类器官（VOs）中细胞的可视化与精准追踪，为实时监测血管生成过程提供了有力手段。
高通量可量化的血管生成检测模型
团队开发出一种基于血管类器官的可视化、可量化血管生成检测方法。通过检测上清液中的分泌型纳米荧光素酶（secNluc）水平，简化了血管网络的定量分析流程。此方法不仅提高了检测效率和准确性，还适用于大规模药物筛选，为抗血管生成治疗新药的研发提供了坚实的平台支撑。
研究内容
血管生成的生物学意义与挑战
血管生成是新血管从已有的毛细血管生成的过程，由促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡进行调控。在组织修复、胚胎发育等正常生理过程中，血管生成受到严格管控。但血管生成一旦失调，就会引发类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化等病理状况。尤其在恶性肿瘤发展中，异常的血管生成起着关键作用。尽管针对 VEGF 途径的抗血管生成治疗已被广泛应用，可副作用和药物耐受性问题突出，迫切需要研发新型治疗药物。
现有血管生成检测方法的局限性
ChinaBio生物医药投融资大会了解到，在药物研发过程中，高通量分子筛选是识别特定蛋白质或简单生物过程抑制剂的有效方式。然而，当下急需可靠、成本效益高且读数简便的血管生成检测方法。现有的管形成型实验、纤维蛋白珠实验和主动脉环实验等都存在一定缺陷：
管形成型实验：常被用于体外研究血管生成，将血管内皮细胞接种在铺有基质胶的培养板上，细胞会形成类似血管的管状结构，通过观察管的数量、长度等指标评估血管生成能力或药物影响。该实验操作相对简便，能模拟部分体内血管生成过程，但无法完全重现人体血管的三维复杂结构，量化过程多依赖形态学评估和图像分析，在高通量筛选方面存在局限。
纤维蛋白珠实验：把含有血管内皮细胞的纤维蛋白珠置于特定培养环境，观察内皮细胞迁移、增殖形成血管样结构的过程，评估指标包括细胞迁移距离等。此实验可研究细胞与细胞外基质相互作用对血管生成的影响，但同样难以模拟体内血管三维结构，实验流程复杂，量化分析困难，不利于高通量药物筛选。
主动脉环实验：取动物主动脉切成小段环状进行培养，观察其中细胞生长、迁移形成毛细血管样结构的情况，以此评价血管生成活性或药物作用效果。该实验能保留血管组织部分特性，但操作复杂，难以实现高通量检测，量化依赖形态学观察和图像分析，限制了其在大规模药物筛选中的应用。
近年来，干细胞衍生的血管类器官（VOs）通过模拟人类血管结构和功能，不仅能更准确地重现体内血管生成过程，还为高通量药物筛选提供了理想平台。
PECAM1-mRuby3-secNluc; ACTA2-EGFP 双报告基因细胞系的构建
为开发基于 VOs 的创新血管生成检测方法，研究团队利用 CRISPR/Cas9 技术，在内源性 PECAM1 和 ACTA2 基因位点引入荧光标签（图 1a），成功构建双报告基因的人类多能干细胞系（hESC）。ChinaBio生物医药投融资大会了解到，这一设计将 CD31 表达水平与上清液中分泌型纳米荧光素酶（secNluc）水平相关联，以反映血管生成效果。通过正交选择策略和已有的 ACTA2-EGFP 细胞系构建方法，团队高效建立了 PECAM1-mRuby3-secNluc; ACTA2-EGFP 双报告细胞系，并通过 PCR 和 Sanger 测序验证了基因敲入的特异性和准确性。编辑后的 hESC 保持了 OCT4 和 SOX2 等多能性标志物的正常表达，通过二维分化展示了 ECs 和 SMCs 的准确荧光标记，验证了标记的真实性（图 1b）。
可视化与可量化的体外血管生成模型
利用 PECAM1-mRuby3-secNluc; ACTA2-EGFP 双报告细胞系，研究团队开发出可视化和可量化的体外血管生成模型。将 VOs 嵌入水凝胶后，形成的血管网络在共聚焦显微镜下清晰可见，无需复杂免疫染色，ECs 和 SMCs 的信号就能清晰分离（图 1c）。该模型不仅能快速评估血管网络形态学，还通过检测上清液中的 secNluc 水平简化了定量分析，适用于高通量筛选。进一步实验表明，该模型能准确再现正常血管结构（图 1d），应用 VEGFR 抑制剂 SU5416 后，血管网络显著缩小，荧光强度降低，验证了模型的有效性（图 1e-g）。
高通量筛选工作流程的设计与验证
为设计基于 secNluc 的高通量筛选工作流程，研究团队先验证了上清液中 secNluc 水平与 ECs 数量的正相关性。在 EGM2 培养基中培养纯化的 ECs，24 小时后测量 secNluc 水平，发现生物发光强度与细胞数量呈正相关，且随 ECs 增加近乎成比例（图 1h），确认了 secNluc 作为读数的可行性。随后，以 VEGFR 抑制剂 SU5416 为阳性对照建立筛选工作流程，在第 5 天观察到生物发光强度的差异（图 1i-j）。不过在第 3 天时，血管网络结构已被破坏，提示评估处理效果时，需结合 secNluc 和形态学评估，以全面捕捉响应。
多路径抑制剂筛选与模型应用
为评估该检测方法在识别新型靶点方面的实用性，研究团队测试了一组针对 TGF-β、FGF、PDGF、Wnt、BMP、Notch、YAP 和 c-Met 路径的抑制剂。结果显示，抑制 YAP、BMP、c-Met 或激活 Wnt 路径，会显著抑制血管生成（图 1k）。其中，选择性 TGFβR1 抑制剂 Repsox 表现出强烈的促血管生成效果，而 SB431542（抑制 ALK4、ALK5 和 ALK7）仅轻度抑制血管生成并抑制 SMCs 的扩展。进一步研究表明，Repsox 可能通过促进 SMC 成熟和增强内皮屏障形成来促进血管生成，这表明该模型在发现新型血管生成调控剂方面具有广阔应用潜力（图 1l）。
研究总结
成功构建功能性血管类器官模型
研究团队利用 PECAM1-mRuby3-secNluc; ACTA2-EGFP 双报告基因细胞系，开发出可视化和可量化的体外血管生成模型。
全面验证血管类器官模型的可靠性与应用潜力
通过验证 VEGFR 抑制剂和多个血管生成调节因子的效果，展示了该模型在高通量药物筛选中的潜力。与传统血管生成检测方法相比，该模型虽需对干细胞进行双步基因编辑，但通过快速富集编辑细胞，克服了编辑效率的挑战，适用于多种人类多能干细胞系。
未来展望
推动抗血管生成新药的高效筛选
进一步优化和标准化筛选流程，可加速新药研发进程，满足临床对更高效、更安全抗血管生成治疗药物的需求。
拓展类器官技术在精准医疗中的应用
为不同患者群体量身定制治疗方案，推动医学研究向更高精度和个性化方向发展。
文章来源：大橡科技
